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紅霉素N脫甲基酶(ERND)測試盒(比色法)
AS6321265
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紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性測定試劑盒說明書

                                                      微量法 100T/48S

注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系,在外源物質代謝中,尤其是藥物和毒物的代謝,具有重要作用。ERND在P450酶系中相當于CYP2B亞型,與藥物代謝的去甲基化密切相關。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產物而具有解毒作用,也可使某些藥物經CYP2B代謝活化。

測定原理:

ERND催化紅霉素釋放甲醛,通過Nash比色測定甲醛含量,即可計算出ERND活性。

自備儀器和用品:

普通離心機,超速離心機、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水和冰。

試劑組成和配置:

試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水溶解。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加1mL蒸餾水,充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加0.5mL蒸餾水,充分溶解。

試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前,加蒸餾水4.5mL充分溶解。

試劑六:液體×1瓶,4℃保存。

試劑七:液體×1瓶,4℃保存。

標準液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管,加入10μl標準液,加990μl蒸餾水,混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液,4℃保存。

粗酶液提?。?/p>

1、除去細胞核,線粒體等大分子物質:稱約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液,轉入超速離心管中。

2、粗制微粒體:100 000g,4℃,離心60min,棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質:向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。

4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。該待測液需當天使用。

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到412 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30 min。

3. 對照管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL蒸餾水,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A對照管。

4. 測定管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A測定管。

5. 標準管:取0.5mL EP管,加入100μL標準品,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A標準管。

注意:每個樣品都需要做對照管。

ERND活性計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義:37℃下,每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(Cpr×V樣)÷T

= 45×(A測定管-A對照管)÷A標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質量計算:

活性單位定義:37℃下,每分鐘每克樣品催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V樣)÷T

= 45×(A測定管-A對照管)÷A標準管÷W

C標準品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標準品:100μL=1×10-4 L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W:樣品質量,g;V樣:加入粗酶液體積,10μL=0.01mL;T:催化反應時間(min),30min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義:37℃下,每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(Cpr×V樣)÷T

= 45×(A測定管-A對照管)÷A標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質量計算:

活性單位定義:37℃下,每分鐘每克樣品催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V樣)÷T

= 45×(A測定管-A對照管)÷A標準管÷W

C標準品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標準品:100μL=1×10-4 L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W:樣品質量,g;V樣:加入粗酶液體積,10μL=0.01mL; T:催化反應時間(min),30min。

 

 

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