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多聚半乳糖醛酸酶(PG)測試盒(比色法)
AS6321403
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多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonase,PG)試劑盒說明書

微量法100T/48S

注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)是一種細胞壁結合蛋白,可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,參與果膠的降解,使細胞壁結構解體,導致果實軟化,與果實成熟、葉和花的脫落、病原物防御,細胞伸展發育以及木質化有關,在植物抗病性和食品貯藏保鮮領域具有較高的研究價值。

測定原理

多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸,具有還原性醛基,與DNS試劑反應生成紅棕色物質,在540nm有特征吸收峰,測定540nm處吸光值變化可計算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體8mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體15mL×1瓶,4℃避光保存。

酶液提取

1.組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。16000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后16000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。

3.培養液:直接檢測。

測定操作表

 

對照管

測定管

樣本(μL)

 

30

煮沸樣本(μL)

30

 

試劑一(μL)

 

120

蒸餾水

120

 

40℃水浴30min

試劑二(μL)

150

150

沸水浴5min,冰浴或自來水冷卻,取200μL于微量石英比色皿/96孔板測定540nm處吸光值A,△A=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。

酶活性計算公式

  1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y = 3.9642x - 0.008;R2 = 0.9996;x為標準品濃度,mg/mL;y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/mg prot)= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×Cpr)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每克樣本每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3.按液體體積計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每毫升培養液每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

4. 按細胞數量計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每104個細胞每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/104cell)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數量    

V反總:反應總體積,0.15mL;V樣:反應中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,0.5h

  

  1. 96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y = 1.9821x - 0.008,R2 = 0.9996;x為標準品濃度,mg/mL;y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×Cpr)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每克樣本每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位(U)。

PG活性(mg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3.按液體體積計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每毫升培養液每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位(U)。

PG活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

4. 按細胞數量計算

酶活性定義在40℃,pH6.0條件下,每104個細胞每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位(U)。

PG活性(mg/h/104cell)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數量

V反總:反應總體積,0.15mL;V樣:反應中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,0.5h

注意事項

煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘,以將酶徹底滅活。

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