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果膠裂解酶測試盒(比色法)
AS6321401
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果膠裂解酶(pectinate lyases,PL)試劑盒說明書

                                          微量法100T/48S

注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

果膠裂解酶(EC4.2.2.10)是果膠酶的重要組成部分,是一種能降解植物細胞壁,導致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶,來源比較廣泛,主要來源于微生物,可用于果汁、果酒的澄清,提高水果出汁率,植物病毒的純化,紙漿的漂白和紡織品的生物精煉,在減少環境污染和降低能源消耗方面具有潛在的應用價值。

測定原理

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵,生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸,在235nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體6mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體6mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體6mL×1瓶,4℃保存。

酶液提取

1.組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g ,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

3. 培養液:直接測定。

測定操作表

  1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長至235nm,蒸餾水調零。
  2. 操作表

 

對照管

測定管

試劑一(μL)

 

120

試劑二(μL)

120

 

40℃溫育3min

酶液(μL)

20

20

混勻,40℃反應30min

試劑三(μL)

60

60

混勻于微量石英比色皿/96孔板(UV板)測定235nm處吸光值A,△A=A測定管-A對照管。

酶活性計算公式

  1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1. 組織中PL活性

(1)按照蛋白濃度計算

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每毫克蛋白每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/mg prot)= △A÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T

= 64.1×△A÷Cpr

(2)按照樣本質量計算

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每克組織每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/g 鮮重)= △A÷(ε×d)×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T

= 64.1×△A÷W

2. 細菌、真菌PL活性

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每104個細胞每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/104cell)= △A ÷(ε×d)×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)÷T 

 = 64.1×△A÷細胞數量

3. 培養液PL活性

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每毫升培養液每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/mL)= △A÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T

= 64.1×△A

ε:不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數:5200L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:反應體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,30min

  1. 用96孔板測定的計算公式如下

1. 組織中PL活性

(1)按照蛋白濃度計算

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每毫克蛋白每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/mg prot)= △A÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T

= 128.2×△A÷Cpr

(2)按照樣本質量計算

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每克組織每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/g 鮮重)= △A÷(ε×d)×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T

= 128.2×△A÷W

2. 細菌、真菌PL活性

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每104個細胞每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min/104cell)=△A÷(ε×d)×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)÷T 

    = 128.2×△A÷細胞數量

3. 培養液PL活性

酶活性定義在40℃,pH5.5條件下,每毫升培養液每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性(nmol/min//mL)= △A÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T

= 128.2×△A

ε:不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數:5200L/mol/cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:反應體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,30min

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