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果膠酶測試盒(比色法)
AS6321400
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果膠酶(pectinase)試劑盒說明書

                                          微量法100T/48S

注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質酶類的總稱,包括原果膠酶,果膠酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類,廣泛存在于植物果實和微生物中,主要用于食品、釀酒、環保、醫藥、紡織及日化用品行業。

測定原理

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸,具有還原性醛基,與DNS試劑反應生成紅棕色物質,在540nm有特征吸收峰,測定540nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存;臨用前加入7.5mL試劑一,50℃加熱溶解,用不完的試劑4℃保存一周。

試劑三:液體20mL×1瓶,4℃避光保存。

酶液提取

1.組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。

3. 細胞培養液等:直接檢測。

測定操作表

 

對照管

測定管

試劑二(μL)

120

120

50℃水浴溫育5min

樣本(μL)

 

30

煮沸樣本(μL)

30

 

混勻,50℃水浴反應30min

試劑三(μL)

150

150

沸水浴5min,冰浴冷卻終止反應,8000g,4℃,離心10min,蒸餾水調零,取上清于微量石英比色皿或96孔板測定540nm處吸光值A,△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。

酶活性計算公式

  1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y = 3.9642x - 0.008;R2 = 0.9996;x為標準品濃度,mg/mL;y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性(mg/h/mg prot)= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×Cpr)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每克樣本每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性(mg/h /g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細胞數量計算

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每104細胞每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

 

果膠酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數量

4.細胞培養液

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每毫升培養液每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反總:反應總體積,0.15mL;V樣:反應中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,0.5h

  1. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y = 1.9821x - 0.008,R2 = 0.9996;x為標準品濃度,mg/mL;y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠產。生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×Cpr)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每克樣本每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

 

果膠酶活性(mg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細胞數量計算

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每104細胞每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數量

4.細胞培養液

酶活性定義在50℃,pH3.5條件下,每毫升培養液每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反總:反應總體積,0.15mL;V樣:反應中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,0.5h

注意事項

  1. 試劑二若有沉淀析出,請置于50℃加熱溶解。
  2. 測定之前請先做預實驗,如果吸光值較高或較低,請用提取液做適當的稀釋或者加大樣本量,并在計算公式中乘以稀釋倍數或者以實際加入的樣本體積參與計算。
  3. 煮沸樣本建議在沸水中煮沸10分鐘,以將酶徹底滅活。
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